· 储存条件 : 18-25℃保存，有效期2年。

· 单位 : 盒

保存：18-25℃保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后置于常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

试剂盒内容：

样本稀释液 200mL

清洗液 200mL

脾脏组织淋巴细胞分离液 200mL

F 液 200mL

操作步骤：

一、 脾脏组织单细胞悬液的制备方法

注：A．全过程及所需试剂要求无菌环境。

B．本试剂盒中不包含胶原酶，若采用酶消化法制备单细胞悬液，请用户根据各实验室要求另购不同类型胶原酶。

1. 剪碎法：将组织块放入平皿后，加入少量F液及20%胎牛血清；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入5mL F液及20%胎牛血清；用吸管吸取组织匀浆，用100目不锈钢滤网(另购)过滤到试管内；离心沉淀1500转/分×3 min，再用细胞清洗液清洗3次，每次以500rpm短时低速离心除去细胞碎片，以200目不锈钢滤网（另购）过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×10⁷个/mL。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或样本稀释液悬起细胞浓度为2×10⁸~1×10⁹个/mL的单细胞悬液备用。

2. 匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入70mL组织研磨器内，加入2mLF液及20%胎牛血清；缓慢转动研棒，研磨至匀浆；用5mLF液及20%胎牛血清冲洗研器；收集细胞悬液，经200目不锈钢滤网（另购）过滤；离心沉淀800rpm×2min ，再用细胞清洗液洗3次，离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×10⁷个/mL。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或样本稀释液悬起细胞浓度为2×10⁸~1×10⁹个/mL的单细胞悬液备用。

3. 酶消化法：

A．用F液将胶原酶稀释，终浓度为400 U/mL，至于冰浴备用。

B．取一适当大小培养皿进行操作：用镊子夹碎动物脾脏，加入稀释后的胶原酶，37℃消化20分钟。

C．以100或200目不锈钢滤网（另购）过滤，离心沉淀800prm×2min ，再用细胞清洗液洗3次，离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×10⁷个/mL。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或样本稀释液悬起细胞浓度为2×10⁸~1×10⁹个/mL的单细胞悬液备用。

细胞计数方法:

细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板）进行。既可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。

计数与计算过程

1）在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。

2）用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。

3）置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。

4）按下式计数细胞悬液的密度：细胞密度＝（4个大格细胞总数/4）×10⁴个/mL×稀释倍数

公式中乘以10⁴ 因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm³而 1mL＝1000mm³

细胞计数要点：

A．进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于10⁴个/mL，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分; 或细胞数<200个/10mm²或>500个/10 mm² 时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。

B．要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

C．取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

D．数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。

E．操作时，注意盖玻片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

二、脾脏淋巴细胞分离方法

1. 取一支15ml离心管，加入与脾脏组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于3ml）。

2. 用吸管小心吸取脾脏组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g，离心20-30min。（注：根据脾脏组织单细胞悬液量确定离心条件，脾脏组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件可以客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。

3. 离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层;为稀释液层。第二层；为环状乳白色淋巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。

4. 用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。

5. 250g，离心10min。

6. 弃上清。

7. 用吸管以5ml清洗液重悬所的细胞。

8. 250g，离心10min。

9. 重复6、7、8，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。

注意事项

1. 全程过程样本、试剂及实验环境均需要在20℃±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最好在取血后2h内进行实验，血液存放时间越久，分离效果越差。血液放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

2. 本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理后的玻璃制品，因为静电作用会导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。

3. 吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交接处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。

4. 分离液用量大于脾脏组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。

浓度
规格	200ml/KIT
保存	18-25℃保存，有效期2年。

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